Главная » 2013 » Октябрь » 28 » Скачать Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы. Кекеева, Татьяна Владимировна бесплатно
12:16
Скачать Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы. Кекеева, Татьяна Владимировна бесплатно
Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы
Диссертация
Автор: Кекеева, Татьяна Владимировна
Название: Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы
Справка: Кекеева, Татьяна Владимировна. Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы : диссертация кандидата медицинских наук : 14.00.14 / Кекеева Татьяна Владимировна; [Место защиты: ФГУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт"] Москва, 2008 80 c. :
Объем: 80 стр.
Информация: Москва, 2008
Содержание:
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ ? 1 >
11: Этиология и патофизиология рака предстательной железы
12 Прогностические факторы рака предстательной железы
13 Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы
131 Хромосомные перестройки
132 Потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность
133 Аномальное метилирование
134 Обнаружение опухольспецифичной ДНК в биологических жидкостях
14 Опухолевое микроокружение
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Клинический материал
22 Забор крови, операционного и биопсийного материала
23 Лазерная микродиссекция
24 Выделение геномной ДНК
25 Выделение РНК
26 Синтез кДНК
27 Полимеразно-цепная реакция для определения химерных генов
2 8 Рестрикционный анализ
2 9 Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР)
2 10 Обработка ДНК бисульфитом натрия
2 11 Секвенирование
212 Микросателлитный анализ
2 13 Электрофорез в ПААГ
2 14 Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
2 15 Программное обеспечение
216 Статистическая обработка данных
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Анализ хромосомных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV1
311 Анализ хромосомных перестроек в образцах ДГПЖ
312 Анализ хромосомных перестроек в образцах РПЖ
313 Клинические ассоциации перестройки TMPRSS2/ERG4
32Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности
321 Анализ ПГ/МН в биоптатах РПЖ
322 Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах РПЖ
323 Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах ПИН
324 Ассоциации частот ПГ/МН с клиническими параметрами
33 Анализ аномального метилирования
331 Метилирование генов в микродиссекционных образцах
332 Метилирование генов в биопсийных и послеоперационных образцах
333 Ассоциации частот метилирования исследуемых генов в образцах биоптатов с клиническими параметрами
34 Анализ аномального метилирования в плазме крови пациентов с РПЖ
35 Анализ частоты генетических и эпигенетических нарушений в строме РПЖ
Введение:
Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста.
В настоящий момент основным диагностическим критерием РПЖ является патологоанатомическое исследование. Молекулярно-генетические же маркеры в клинической практике применяются в исключительных случаях или находятся в стадии научных разработок. В опухолевых тканях обнаруживается большое количество структурных перестроек, прежде всего транслокаций и делеций, количество которых заметно нарастает по мере прогрессирования злокачественного роста. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 с последующей гиперэкспрессией химерных онкогенов. Гомозиготные и гетерозиготные делеции, являются одними их самых частых генетических патологий РПЖ. Также одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза РПЖ является аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста. Учитывая, что молекулярные изменения являются наиболее ранними в канцерогенезе, применение подобных маркеров в клинике могло бы расширить возможности ранней диагностики и увеличить ее прогностический потенциал. Таким образом, приоритетным направлением в диагностике РПЖ является поиск и характеристика новых молекулярно-генетических маркеров с достаточной чувствительностью и специфичностью для применения в клинической практике.
За последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получено большое число убедительных данных, свидетельствующих о критической роли стромы в канцерогенезе. Опухолевая прогрессия зависит не только от молекулярных изменений эпителиальных клеток, но и от многочисленных изменений смежной стромы, обеспечивающей необходимое окружение для пролиферации, миграции, инвазии опухолевого эпителия в процессе неопластического роста. Изменения, происходящие в строме, включают изменения в профиле экспрессии ростовых факторов, цитокинов, преобразования в цитоскелете фибробластов и экстрацеллюлярном матриксе. Показано, что микроокружение способно стимулировать опухолевый рост эпителия, но и сама строма подвергается значительной модификации: изменению профиля экспрессии белков и различным генетическим перестройкам. Молекулярные повреждения генома стромальных клеток, такие как гиперметилирование генов-супрессоров, изменение длины теломер, потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МЫ) на различных хромосомах, мутации, имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия. Однако сведения об эпигенетических и генетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения для идентификации новых маркеров, терапевтических мишеней и понимания механизмов возникновения опухоли в целом.
Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и ее микроокружении, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров РПЖ.
Цель работы — изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих на разных этапах канцерогенеза РПЖ в ткани опухоли, в опухолевом эпителии и смежной с ним строме.
Задачи исследования.
1. Определить частоту химерных онкогенов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в ткани РПЖ и оценить их диагностическую значимость.
2. Оценить частоту ПГ/МН локусов 8р22, 13ql4 и 16q23 в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, а также при предраковых состояниях ПИН.
3. Охарактеризовать частоту метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Провести сравнение частот метилирования изученных генов в микродиссекционных и биопсийных образцах предстательной железы.
4. Провести сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме.
5. Выявить возможные ассоциации между изученными генетическими и эпигенетическими изменениями и клиническими параметрами РПЖ.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования изучены генетические и эпигенетические изменения РПЖ на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез с применением метода лазерной микродиссекции. Впервые охарактеризованы молекулярно-генетические изменения стромального опухолевого микроокруження. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме намного превышает таковую в эпителии.
Впервые на российской выборке охарактеризована частота химерных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 и показана специфичность этих нарушений для РПЖ.
Практическая значимость.
Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения РПЖ. В работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверное различие по частотам образования химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.
В результате исследования обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 обнаружены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 обнаружено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Обнаруженные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.
Полученные результаты могут служить для разработки диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений, что позволит проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять риск метастазирования в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.
Апробация работы.
Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2008 г.г., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г., на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2006-2007 г., на I и II онкоурологических конгрессах в 2006-2007 г.
Работа удостоена золотой медали Российской академии медицинских наук на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 году. Работа заняла 1 место в конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) в номинации «медицинская наука» в 2007 г.
По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 тезисов и 2 медицинских технологии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Экспрессия TMPRSS2/ERG4 является частым, специфическим для РПЖ, событием и может быть использована как маркер РПЖ, а также маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию.
2. Высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам и метилирования изученных генов характерна как для эпителия РПЖ, так и для смежной с ним стромы. На ранних этапах канцерогенеза аллельные нарушения в строме преобладают над таковыми в эпителии.
3. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны.
4. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса 16q23 и метилирование генов GSTP1 и N33 ассоциированы с прогресией РПЖ и могут использоваться в качестве диагностических маркеров.