| Миграция транспозонов и нереплицирующихся плазмид в клетках фототрофной азотфиксирующей бактерии Rhodopseudomonas sphaeroides
Диссертация
Автор: Дубейковский, Александр Николаевич
Название: Миграция транспозонов и нереплицирующихся плазмид в клетках фототрофной азотфиксирующей бактерии Rhodopseudomonas sphaeroides
Справка: Дубейковский, Александр Николаевич. Миграция транспозонов и нереплицирующихся плазмид в клетках фототрофной азотфиксирующей бактерии Rhodopseudomonas sphaeroides : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.15 Москва, 1984 154 c. : 61 85-3/19
Объем: 154 стр.
Информация: Москва, 1984
Содержание:
I ВВЕДЕНИЕ
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Мигрирующие генетические элементы прокариот
211 Определение и классификация мигрирующих генетических элементов
212 Структурная и функциональная организация is- последовательностейЮ
213 Сложные транспозоны
214 Транспозон ТпЗ и родственные ему транспозоны ?
215 Мигрирующие бактериофаги
216 Эффекты, вызываемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК: регуляция действия генов
217 Перестройки,индуцируемые мигрирующими элементами в реципиентной ДНК
218 Эксцизия мигрирующих элементов
219 Образование коинтегратов мигрирующими элементами
2110 Обратная транспозиция
2111 Специфичность транспозиции мигрирующих элементов
2112 Мутации хозяйского генома, влияющие на события "незаконной" рекомбинации, ассоциированные с мигрирующими элементами
2113 Модели транспозиции
22 Генетический анализ у фотосинтезирующих пурпурных бактерий
III МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ
31 Бактериальные штаммы
32 Плазмиды и бактериофаги
33 Среды и реактивы
34 Конъюгационные скрещивания
35 Определение частоты транспозиции
36 Иммунность к колицину EI
37 Несовместимость автономных плазмид
38 Получение спонтанных ап8-вариантов плазмиды
39 Мутагенез
310 Ампициллиновое обогащение
311 Поиск ауксотрофов, индуцированных внедрением транспозона Тп7 и плазмид pAS8-i2i/pAS8-i2I3/
312 Выделение плазмидной ДНК
313 Выделение ДНК фага
314 Обработка препаратов ДНК эндонуклеазами рестрикции
315 Электрофоретический анализ препаратов ДНК
316 Определение молекулярного веса фрагментов линейной ДНК
IV; ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
41 Миграция транспозона ад с плазмиды pAS8-i2i
В Геном Eh sphaeroides 2R
42 Локализация включений транспозона Тп7 в геноме Hhsphaeroides 2К
43 Включение транспозона ад в геномы штаммов 28-5, 241 ,KS630 Hhsphaeroides
44 Получение плазмиды pAS8-i2i::Тп5 и её Стр введение в пурпурную бактерию
45 Конъюгативная передача плазмид штаммами 2R::pAS8-I2I И 2Е s :pAS8-I2I^
46 Вторичные перестройки хромосомы, обусловленные транспозоном Тп? и плазмидой pAS8-i2i
47 Экспрессия несовместимости штаммами 2Е: :pAS8-i2i
48 Формирование к* плазмид в межродовом скрещивании Eh sphaeroides 2Е::pAS8-I2I с
Ecoli HBIOI
49 Участие транспозона Тп7в наследовании плазмиды PAS8-I2I в Eh sphaeroides 2Е
410 Экспрессия свойств транспозоном ТпАв
Eh sphaeroides 2R
411 Наследование плазмиды PAS8-I2I и её производных в штаммах 2Е:;0?п7
V ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
51 Свойства транспозона Wb штаммахHhsphaeroides
52 Природа штаммов 2R::pAS8-i2l
53 Происхождение Е1 плазмид, обнаруженных в межродовых скрещиваниях
54 Экспрессия Р несовместимости штаммами
2Е г:pAS8-I2I
55 Свойства транспозона Тп5вRhsphaeroides 2R
Введение:
В последнее время фотосинтезирующие микроорганизмы стали объектами пристального внимания и тщательного изучения исследователей разных специальностей / микробиологов, биохимиков, генетиков и так далее /. Неослабевающий интерес к данным микроорганизмам вызван в первую очередь их уникальной способностью к фотоассимиляции неорганических углерода / СО2 / и азота . Такая автономность и непосредственное эффективное преобразование солнечной энергии делает привлекательной перспективу использования фотосинтезирующих микроорганизмов в качестве промышленных продуцентов медицинских препаратов» кормовых добавок, удобрений, топлива/Н2/ ,органической биомассы и так далее. Необходимость скорейшего решения этих задач диктуется быстрым сокращением мировых запасов ископаемого топлива, большая часть которого расходуется как раз на получение указанных продуктов. Эффективное прикладное использование фотосинтезирующих микроорганизмов невозможно без знаний об организации их генетического аппарата и в частности генов фотосинтеза и азотфиксации. Работы в данном направлении начаты сравнительно недавно (Saunders, I978;Marrs, 1982) и ведутся широким фронтом на многих фотосинтетиках. Объектом нашего исследования является пурпурная бактерия Rh.sphaeroides штамм 2Е. Бактерия является типичным представителем фотосинтезирующих /азот-фиксирующих/ микроорганизмов и обладает рядом преимуществ перед другими бактериями как модельный объект при изучении бактериального фотосинтеза и азотфиксации. У Eh.sphaeroides , к сожалению, не найдено собственных природных систем обмена генетической информацией, что делает актуальной задачу создания искусственных систем переноса генов у бактерии. В настоящее время с этой целью у микроорганизмов с успехом используются плазмиды с широким кругом хозяев (Datta et ai,
1971) и мигрирующие генетические элементы ( Смирнова и др.,1980а,б; Merrick et al,I979).
Целью настоящей работы был анализ существующих и поиск новых систем для введения транспозонов в пурпурную бактерию Rh.sphaeroides и исследование особенностей транспозиции у фотосинтезирующих бактерий. Конкретные задачи работы сводились к следующему: первое, с помощью плазмид с широким кругом хозяев выяснить экспрессию детерминант устойчивости ряда транспозонов в пурпурной бактерии; второе, найти оптимальную систему для введения транспозонов в Eh.sphaeroides ; третье, выявить характеристики процесса миграции Тп- элементов в различные штаммы пурпурной бактерии / частоту и специфичность миграции транспозонов, способность формировать коинтеграты, способность вызывать хромосомные перстройки, стабильность внедрений и так далее /; четвёртое, сконструировать штаммы пурпурной бактерии с Тп-элементами, пригодные для изучения мобилизации хромосомных генов.
В результате проведённых экспериментов удалось: впервые обнаружить эффективную селективную систему для введения мигрирующих элементов в широкий круг грамотрицательных бактерий на основе гибридной плазмиды pAS8-i2i ; модифицировать плазмиду pAS8-i2i с целью введения в её состав транспозонов, определяющих устойчивость к ка-намицину, тетрациклину , стрептомицину и триметоприму; осуществить транспозицию элементов Тп7 и Тп5 в геном Eh.sphaeroides штаммов 2E,2.4.i.,28-5,RS630 ; впервые продемонстрировать отсутствие экспрессии генов репликации плазмиды CoiEi в пурпурной бактерии и как следствие этого способность плазмиды pAS8-i2l наследоваться стабильно целиком только в интегрированном состоянии в хромосоме} впервые показать, что плазмида PAS8-I2I способна формировать к* варианты с фрагментами хромосомы пурпурной бактерии; выявить участие собственных мигрирующих элементов гибридной плазмиды в её наследовании клетками Rh.sphaeroides.
Практическая ценность работы состоит в получении коллекции стабильных инсерционных мутантов пурпурной бактерии, включая варианты с повреждениями фотосинтетического аппарата; получении набора штаммов с интегрированной в различные участки хромосомы плазмидой PAS8-I2I . Эти штаммы используются в настоящее время в нашей лаборатории при проведении генетического анализа у Eh.sphaeroides 2К.
Предложенные в работе методы с некоторыми модификациями могут быть использованы в генетических исследованиях других грамотрица-тельных бактерий, включая микроорганизмы, имеющие важное промышленное, сельскохозяйственное и медицинское значение( см. например, Sato et al, 1981* Weiss, Falkow, I98J).
|