Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры
Диссертация
Автор: Степаненко, Ольга Викторовна
Название: Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры
Справка: Степаненко, Ольга Викторовна. Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 / Степаненко Ольга Викторовна; [Место защиты: Ин-т цитологии РАН] Санкт-Петербург, 2008 132 c. : 61 08-3/357
Объем: 132 стр.
Информация: Санкт-Петербург, 2008
Содержание:
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Цель и задачи исследования
Основные положения, выносимые на защиту
Научная новизна исследований
Теоретическое и практическое значение работы
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Современные представления о фолдинге белков
111 Сворачивание белков в клетке
112 Модель энергетической воронки Роль внутри- и межмолекулярных взаимодействий в фолдинге и нарушении фолдинга белков
12 Периплазматические лиганд-связывающие белки
121 И-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli
1211 Структура GGBP и его комплекса с О-глюкозойЛЗ-галактозой
1212 Спектральные свойства GGBP и GGBP/Glc
1213 Тепловая денатурация GGBP Роль лигандов — D-глюкозы и иона кальция — в стабилизации структуры белка
122 Глутамин связывающий белок из Escherichia coli
1221 Структура GlnBP в свободном состоянии и в комплексе с Gin
1222 Спектральные свойства GlnBP и GlnBP/Gln
1223 Изучение структуры и стабильности GlnBP и комплекса GlnBP/Gln при тепловой денатурации
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Материалы
22 Методы
221 Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых и тирозиновых остатков
222 Фпуорещентные измерения
223 Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
224 Круговой дихроизм
225 Измерение равновесных кривых денатурации
226 Измерение кинетических кривых разворачивания-сворачивания белков
227 Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы
228 Расчет констант скоростей процессов сворачивания-разворачивания
229 Расчет термодинамических параметров
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Процессы сворачивания-разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc
311 Анализ микроокружения триптофановых и тирозиновых остатков GGBP в отсутствие и в присутствии лиганда
312 Триптофановая флуоресценция GGBP и его комплекса с D-глюкозой в нашивном и полностью развернутом состоянии
313 Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl
314 Ренатурация GGBP
315 Тепловая денатурация GGBP и GGBP/Glc
316 Отщепление иона кальция
32 Процессы сворачивания-разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/Gln
321 Триптофановая флуоресценция GlnBP и его комплекса с Gin в нашивном и полностью развернутом состояниях
322 Характеристика микроокружения триптофановых остатков GlnBP
323 Флуоресцентные свойства и характеристика микроокружения триптофановых остатков комплекса GlnBP/Gln
324 Тирозиновая флуоресценция GlnBP
325 Зависимость триптофановой флуоресценции GlnBP от длины волны возбуждения 325 Разворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием GdnHCl Равновесные зависимости
326 Кинетика разворачивания GlnBP под действием GdnHCl
327 Параметрическое представление процессов разворачивания GlnBP
328 Ренатурация GlnBP
329 Тепловая денатурация GlnBP и комплекса GlnBP/Gln Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом
33 Сравнение характера процессов разворачивания-сворачивания GGBP с GlnBP
ВЫВОДЫ
Введение:
Процессы разворачивания-сворачиваиия белков, их устойчивость к действию химических денатураптов и нагреванию, структура и механизмы образования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интенсивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира. Актуальность этих исследований обусловлена как их значимостью для решения фундаментальной проблемы фолдипга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в денатурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink,. 1998; Uversky et al., 1999a; Uversky et al., 1999b; Selkoe, 2003) и биотехнологии (Wetzel, 1994; Speed et al., 1996; Fink, 1998). Специфическая ассоциация, приводящая к образованию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых "конформационных болезней"), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативных рекомбинантных белков.
К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга-рефолдинга небольших мономерных белков. Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени. В связи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежащих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотаксиса и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий. В настоящей работе объектами исследования стали глутамин-связывающий белок и D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli. Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и Сахаров. Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурах; Dattelbaum, Lakowicz, 2001) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больных; Staiano et al., 2004). Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.
Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка. В задачи работы входило:
1. Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Б-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl);
2. Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний;
3. Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Е)-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl обратимой;
4. Исследование роли лигандов - глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и D-глюкозы и иона кальция, в случае О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка - в стабилизации структуры этих белков к денатурирующему действию GdnHCl и нагревания.
Основные положения, выносимые па защиту
1. Связывание лиганда стабилизирует структуру лиганд-связывающих белков и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.
2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галакгозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу "все или ничего", при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих состояний является состоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией молекул глутамин-связывающего белка.
3. Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд-связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначительно.
Научная новизна исследований
Результаты исследования процессов разворачивания—сворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, получены впервые. Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl. Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию GdnHCl и нагреванию, по и делает процесс денатурации более кооперативным. Впервые охарактеризована стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса.
Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и Б-галактозаЯ)-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно. Сделано заключение о том, что собственная флуоресценция D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в качестве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для пеинвазивного определения содержания сахара в крови больных диабетом. Тем не менее, существенные изменения пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток - донора и акцептора энергии возбуждения.
На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Предложен метод учета этого эффекта.
Теоретическое и практическое значение работы
Новые данные о процессах сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и Б-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубокого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их структуры к действию различных химических денатурантов и нагреванию. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков.
Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/Э-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое значение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара.
Существенной методической разработкой является установление того факта, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и конформационных изменений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофановых остатков, на составляющие.
Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.
|