Справка: Егорова, Ольга Валерьевна. 17-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.23 Пущино, 2004 136 c. : 61 04-3/1392
Объем: 136 стр.
Информация: Пущино, 2004
Содержание:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Тестостерон и его производные
22 Способы получения 17Р-восстановленных стероидов Преимущества микробиологических методов
23 Биотехнологическое значение процесса 17Р-восстановления 3,17- дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями
24 Микроорганизмы, осуществляющие обратимое 17Р-восстановление 3,17- дикетостероидов
25 Взаимосвязь 17Р-восстановления с другими реакциями трансформации стероидов
26 Ферменты, катализирующие процессы окисления-восстановления стероидов при Сп
261 Типы и свойства 17р-гидроксистероидных дегидрогеназ (17Р-ОН СДГ) млекопитающих
262 17Р-0Н СДГ микроорганизмов
263 Физиологическая роль 17Р-0Н СДГ
264 Субстратная специфичность 17Р-0Н СДГ
265 Индукция 17Р-0Н СДГ
266 Активность 17Р-0Н СДГ и возраст культуры
267 Локализация 17Р-ОН СДГ у микроорганизмов
27 Окисление боковой цепи стеринов микобактериями
271 Получение мутантных штаммов Afyco6ac/mMW
272 Роль процесса 17р-восстановления в окислении стеринов микобактериями и подходы к его регуляции
273 Факторы регуляции процесса 17Р-восстановления
28
Заключение ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
31 Реактивы
32 Микроорганизмы
33 Культивирование бактерий
34 Получение бесклеточного экстракта
35 Определение чувствительности штамма Mycobacterium sp ВКМ Ас-1815 Д к антибактериальным препаратам
36 Мутагенез и селекция штаммов Mycobacterium spp
37 Трансформация стеринов и стероидов
38 Оптимизация 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов
39 Вьщеление и очистка ферментов
310 Измерение активности фермента
311 Электрофорез
312 Изучение физико-химических свойств фермента
313 Трансформация стероидов ферментными препаратами
314 Определение локализации р-ОН СДГ
315 Вьщеление продуктов микробиологической трансформации андроста-1,4- диен-3,17-диона
316 Вьщеление продуктов микробиологической трансформации Р- ситостерина
317 Аналитические методы
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
41 Сопоставительный анализ 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus
42 Определение чувствительности Mycobacterium sp ВКМ Ас-1815 Д к антибактериальньм препаратам
43 Получение мутантных штаммов Mycobacterium spp и определение их способности к росту на 17-кетостероидах и деградации боковой цепи рситостерина
44 Трансформация 17-кето и 17-гидроксистероидов Mycobacterium spp
45 Оптимизация процесса 17Р-восстановленияЗ,17-дикетостероидов
46 Вьщеление продуктов микробиологической трансформации андроста-1,4- диен-3,17-диона
47 Выделение, очистка и изучение свойств 17Р-0Н СДГ Mycobacterium sp Etl
48 Изучение локализации 17р-0Н СДГ Mycobacterium sp Etl
49 Сопоставительный анализ 17р-0Н СДГ активности Mycobacterium spp
410 Биоконверсия Р-ситостерина Л4^со6ас/егш/и spp
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6
ВЫВОДЫ
Введение:
Актуальность проблемы.17Р-восстановление является одной из ключевых реакций трансформации стероидных соединений микроорганизмами, которая играет важную роль в метаболизме стероидных субстратов, регуляции пула восстановительных эквивалентов, детоксикации экзогенных стероидов. Имеются сведения о значении 17Р-гидроксистероидной дегидрогеназы (17Р-0Н СДГ), катализирующей процесс 17р-восстановления, как элемента примодиальной сигнальной системы трансдукции у микроорганизмов (HorinoucM et al., 2003, Sedlaczek, 1988, Dlugonski and Wilmanska, 1998, Zakelj-Mavric et al., 1995).Способность микроорганизмов к образованию 17Р-гидроксистероидов известна с 50х годов. Однако, биохимические основы процесса изучены лишь для нескольких видов бактерий и мицелиальных грибов. Тем не менее, имеющиеся данные позволяют сделать вывод о разнообразии свойств, строения и функций микробных 17Р-0Н СДГ, ответственных за осуществление окисления-восстановления 3,17-дикетостероидов при Сп.17р-восстановление часто сопровождает другие процессы биоконверсии стероидов: моно- или дигидроксилирование стероидного ядра, дегидрирование — гидрирование двойных связей, а также окисление боковой цепи стеринов и прегнанов при Сп.Особое значение обратимое 17р-восстановление 3,17-дикетостероидов имеет в полиферментном процессе трансформации природных стеринов (ситостерина, холестерина и др.). Этот биотехнологический процесс в настоящее время является основным способом получение*- андростендиона (АД) и андростадиендиона (АДД) ключевых предшественников синтеза широкого ряда стероидных фармацевтических субстанций. В качестве биокатализаторов процесса общепризнанно использование стеринтрансформирующих микобактерий с блокированными ферментами расщепления стероидного ядра. Последующее 17р-восстановление АД(Д) приводит к образованию тестостерона и(ли) 1(2)-дегидротестостерона. Направленная регуляция 17ргидроксистероидцегидрогеназной активности микобактерий позволяет, с одной стороны, повысить селективность процесса образования 3,17-дикетостероидов, с другой стороны, открывает перспективы получения тестостерона и его производных в одну биотехнологическую стадию.Как известно, тестостерон и его производные представляют собой фармакологически активные соединения, применяющиеся в терапии различных заболеваний (Машковский, 1997). В настоящее время тестостерон получают четьфехстадийным химическим синтезом из АД (Mahato, Majumdar, 1995).Биотехнологический способ получения тестостерона из ситостерина позволит упростить общую схему получения, повысить эффективность процесса и снизить себестоимость продукта.Между тем, биохимические основы процесса 17р-восстановления, свойства 17Ргидроксистероидных дегидрогеназ у микобактерий практически не изучены, не исследована взаимосвязь процесса с другими реакциями модификации стероидного ядра, сопровождающими окисление боковой цепи стеринов.Высокий биотехнологический потенциал стеринтрансформирующих микобактерий как продуцентов 3,17-дикетостероидов и их 17р-восстановленных аналогов, а также недостаточная изученность основ регуляции 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности обусловили актуальность настоящей работы.Состояние вопроса.Способность к осуществлению 17Р-восстановления стероидов известна для широкого ряда микроорганизмов различного таксономического положения. Однако, большинство публикаций ограничивается лишь констатацией факта образования таких соединений и подтверждением их структуры.Из бактериальных ферментов наиболее изученным является 3(17)ргидроксистероидная дегидрогеназа (3(17)Р-ОН СДГ) Comamonas testosteroni (ранее f идентифицированной как Pseudomonas testosteroni), осуществляющая наряду с 17рвосстановлением кето- и дегидрированием гидроксигруппы при Ci?, также окислительновосстановительные реакции при Сз.Изучены 17Р-0Н СДГ ряда грибных культур (Cylindrocarpon radicicola, Cochliobolus lunatus, Pleurotus ostreatus и др.). При этом ферменты, вьщеленные из различных организмов, отличаются по молекулярному весу, строению, локализации и функциям (Schultz et al., 1977, Payne and Talalay, 1985, Itagaki and Iwaya, 1988, Lanisnik et al., 2000, Lanisnik et al., 2001). Литературные данные о внутриклеточной локализации микробных 17р-0Н СДГ ограничиваются результатами, полученными при фракционировании клеток. Показано, что 17Р-0Н СДГ может находиться как в свободной, так и мембрано-связанной формах.Данные о свойствах, строении и локализации Пр-ОН СДГ микобактерий в доступной литературе отсутствуют.В литературе имеются ограниченные сведения о способности микобактерий восстанавливать 3,17-дикетостероиды в 17-м положении, В частности, была показана принципиальная возможность получения тестостерона из стеринов (фитостерина, холестерина, р-ситостерина) при его трансформации штаммом Mycobacterium sp. NRRL 3805 В и предприняты попытки оптимизации процесса (Jiu et al., 1983, Liu et al., 1994, Lo et al., 2002) Однако, выход тестостерона даже при небольших нагрузках субстрата (1-3 г/л) бьш относительно невысоким (19-20%).Обнаружено, что 17р-восстановление АДД микобактериями сопровождается гидрированием 1(2)-двойной связи. В связи с этим в ряде литературных источников обсуждается вопрос о сопряженности процессов восстановления 17-кетогруппы и 1(2)двойной связи стероидного кольца. Однако биохимический механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и 17Р-восстановления не бьш изучен (Goren et al., 1983, Hung etal., 1994).Целью настоящей работы являлось изучение процесса 17р-восстановления 3,17дикетостероидов микобактериями, деградирующими боковую цепь стеринов.В связи с этим ставились следующие задачи: 1. Провести сопоставительный анализ 17р-гидроксистероиддегидрогеназной активности штаммов, обладающих способностью к деградации боковой цепи стеринов, 2. Исследовать факторы регуляции процесса 17р-восстановления 3,17-дикетостероидов и определить оптимальные условия, обеспечивающие повьш1ение целевой активности.3. Вьщелить и охарактеризовать ферменты, катализирующие 17Р-восстановление 3,17- . дикетостероидов, и изучить их внутриклеточную локализацию.4. Разработать биотехнологический метод получения тестостерона из р-ситостерина с выходом кристаллического продукта, превышающим результаты изестных литературных данных.Научная новизна.Впервые вьщелены и охарактеризованы две внутриклеточные 17Ргидроксистероидные дегидрогеназы Mycobacterium sp. Etl, участвующие в окислительновосстановительных превращениях при Сп. Показано, что 17Р-0Н СДГ (1) - мономер с молекулярной массой 68 000, катализирует 17р-окисление 17Р-гидроксистероидов, тогда как ПР-ОН СДГ (2) - тетрамер с молекулярной массой 210 000 проводит как 17Рвосстановление, так и ПР-окисление. Обнаружено, что Пр-ОН СДГ (2) также катализирует окисление 3-ОН группы 3-гидроксистероидов. Предложен механизм, объясняющий взаимосвязь процессов 1(2)- и Пр-восстановления при трансформации 1 (2)-ненасыщенных 3,17-дикетостероидов, Впервые установлена внутриклеточная локализация 17Р-0Н СДГ в клетках микобактерий. Адаптирован для работы с микобактериями цитохимический метод выявления дегидрогеназной активности ферроцианидом меди. Применение модифицированного метода позволило установить, что 17Р-0Н СДГ локализована преимущественно в периферической зоне цитоплазмы и слабо ассоциирована с цитоплазматической мембраной.Впервые обнаружена внеклеточная 17р-0Н СДГ стеринтрансформирующих микобактерий, входящая в комплекс внеклеточных стероидтрансформирующих ферментов, включающий также 3-гидроксистероид оксидазу, 3-кетостероид-1(2)дегидрогеназу и 1-ен-редуктазу.Практическая значимость работы.С использованием метода химического мутагенеза из коллекционной культуры Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д получен стабильный мутантный штамм Mycobacterium sp. Etl, характеризующимся высокой 17Р-гидроксистероиддегидрогеназной активностью и способностью к окислению боковой цепи стеринов. Оптимизированы условия Првосстановления 3,17-дикетостероидов. Показана возможность микробиологического получения 1 (2)-дегидротестостерона из АДД (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 43% от загруженного субстрата и содержанием основного вещества не менее 98%.Найдены эффективные способы повыщения селективности процессов получения 3,17-дикетостероидов (АД и АДД) из Р-ситостерина за счет снижения 17Ргидроксистероидегидрогеназной активности.Разработан конкурентоспособный метод получения тестостерона в одну биотехнологическую стадию из р-ситостерина (5 г/л) с выходом кристаллического продукта не менее 31-35% и содержанием основного вещества не менее 95%.Использование метода позволит, значительно упростить схему синтеза производных тестостерона и снизить себестоимость конечной продукции.Апробация работы.Материалы диссертации бьши представлены на отечественных и международных конференциях: школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино), International Symposium "Modem problems of microbial biochemistry and biotechnology" (2000, Pushchino), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" (2001, Darmshtadt), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2000, 2003). Основные положения диссертации бьши представлены на совместных семинарах Лаборатории Микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.Публикации.По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи и 3 тезисов.Структура и объем диссертации.Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, которая включает описание методов исследования, используемых материалов и изложения результатов, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 129 страницы машинописного текста, 33 таблицы и 33 рисунка. Библиография включает 131 наименований, из них 121 иностранных работ.